Alat-alat untuk pemeriksaan hematologi

Peralatan-peralatan yang diperlukan untuk pemeriksaan hematologi antara lain:

1. Lanset darah

Lanset darah disposable (sekali buang) diperlukan untuk mendapatkan darah kapiler.Lanset yang baik adalah sekali berujung tajam dan melebar.

 2. Jarum, semprit dan botol

Jarum dan semprit disposable digunakan untuk memperoleh darah vena dan arteri.Jarum hendaknya cukup besar, berujung runcing, tajam dan lurus. Lebih baik lagi jika digunakan jarum dan tabung hampa udara steril (venoject) yang membuat darah terhisap ke dalam tabung dan benar-benar tak tercemar. Botol kecil steril digunakan untuk menampung darah setelah diambil ke dalam semprit.

3. Hemositometer

Hemositometer digunakan untuk menghitung eritrosit, lekosit dan trombosit. Alat ini terdiri atas kamar hitung, kaca penutup dan pipet.

a. Kamar hitung

Kamar hitung yang banyak digunakan adalah improved Neubauer. Gambar detail dari kamar hitung dapat Anda lihat pada gambar.

b. Kaca penutup

Kaca penutup dibuat benar-benar datar, agak lebih tebal dari kaca obyek.

c. Pipet

Pipet yang digunakan adalah pipet Thoma untuk mengencerkan eritrosit, terdiri atas pipa kapiler yang bergaris bagi dan membesar pada salah satu ujung membentuk bola. Di dalam bola terdapat sebutir kaca merah. Pipet Thoma untuk mengencerkan lekosit sama dengan pipet eritrosit, namun didalam bola terdapat sebutir kaca putih.

Hemoglobinometer (hemometer)

Kamar hitung

Pipet Thoma

Hemoglobinometer digunakan untuk mengukur kadar hemoglobin secara sederhana. Hemometer Sahli masih digunakan di laboratorium-laboratorium kecil atau di lembagalembaga pelayanan kesehatan dasar misalnya puskesmas. Sehingga, meskipun cara ini tak dianjurkan karena akurasinya yang rendah namun masih perlu dipelajari. Alat ini terdiri atas HCl, tabung reaksi dan pengaduk, pipet hemogobin serta warna pembanding.

5. Kaca obyek dan kaca penutup

Kaca obyek berukuran 1 x 3 inci. Sebaiknya pinggir kaca obyek benar-benar rata sehingga baik untuk membuat sediaan apus. Kaca penutup harus tipis supaya dapat digunakan untuk pemeriksaan mikroskopis. 

Cara memperoleh sampel darah

Dalam pemeriksaan hematologi umumnya digunakan darah kapiler dan darah vena.

1. Darah kapiler

Darah kapiler diambil dari ujung jari atau anak daun telinga untuk orang dewasa dan dari tumit atau ibu jari kaki untuk bayi. Tak boleh mengambil sampel darah dari bagian tubuh dengan gangguan sirkulasi, misalnya sianosis atau iskemia. Cara mengambil sampel darah kapiler adalah:

a. Lakukan desinfeksi dengan alkohol 70% dan biarkan sampai mengering.

b. Pegang bagian yang dipilih supaya tak bergerak

c. Tekan sedikit untuk mengurangi nyeri

d. Tusuk dengan cepat dan cukup dalam menggunakan lanset. Untuk jari, tusuk secara tegak lurus dengan garis-garis sidik jari, jangan sejajar. Untuk daun telinga, tusuk pinggirnya, jangan sisinya. Jangan dipijat-pijat, karena darah akan bercampur dengan cairan jaringan sehingga menjadi lebih encer, yang berdampak terhadap

akurasi hasil pemeriksaan.

e. Buanglah tetes darah pertama dengan kapas kering.

2. Darah vena

Pada orang dewasa vena yang sering diambil darahnya adalah vena dalam fossa kubiti. Untuk bayi, darah vena dapat diambil dari vena jugularis atau sinus sagitalis superior. Cara mengambil darah vena adalah:

a. Lakukan desinfeksi dengan alkohol 70% dan biarkan sampai mengering.

b. Pasang torniket, sarankan mengepal dan membuka tangan berkali-kali supaya vena terlihat jelas

c. Tegangkan kulit di atas vena dengan tangan non dominan supaya vena tak bergerak

d. Tusuk kulit dengan jarum sampai masuk vena

e. Longgarkan torniket secara perlahan, lalu hisap darah sesuai dengan kebutuhan

f. Buanglah tetes darah pertama dengan kapas kering.

g. Pasang kapas alkohol di atas jarum lalu cabut jarum dengan cepat

h. Tekan daerah tusukan dengan kapas sampai beberapa menit (boleh dilakukan oleh pasien)

i. Cabut jarum dari semprit lalu alirkan darah ke botol secara perlahan melalui dinding botol supaya tidak terjadi lisis sel-sel darah

Pemeriksaan kadar hemoglobin (Hb)

Cara pemeriksaan kadar Hb yang lazim digunakan adalah cara fotoelektrik dan kolorimetrik visual.

 Cara fotoelektrik

Dengan cara ini, hemoglobin diubah menjadi sianmethemoglobin (hemoglobin-sianida) dalam larutan yang berisi kaliumferrisianida dan kalium sianida. Larutan Drabkin mengubah hemoglobin, oksihemoglobin, methemoglobin dan karboksihemoglobin menjadi sianmethemoglobin. Cara ini tidak kita bahas lebih lanjut, yang jelas cara ini sangat bagus untuk laboratorium rutin karena memiliki akurasi yang sangat tinggi.

Cara kolorimetrik visual (cara Sahli)

Dengan cara ini, hemoglobin diubah menjadi hematin asam yang berwarna coklat. Kemudian warna ini dibandingkan dengan warna standar secara visual. Langkah-langkah pemeriksaan dengan cara Sahli yaitu:

a. Masukkan 5 tetes HCl 0,1 N ke dalam tabung pengencer

b. Isap darah kapiler atau darah vena dengan antikoagulan EDTA atau oksalat dengan menggunakan pipet Hb sampai tanda 20 µL tanpa terputus

c. Hapuslah darah diluar ujung pipet

d. Segera alirkan darah ke dasar tabung, jangan sampai ada gelembung udara e. Angkat pipet sedikit lalu hisap HCl 2 atau 3 kali untuk membersihkan darah

f. Aduklah supaya cepat terjadi reaksi antara darah dan HCl. Selama pengadukan tambahkan setetes demi setetes aquades.

g. Setelah 3-5 menit bandingkan warna tersebut dengan warna standar sampai benar-benar sama. Bacalah kadar Hb setinggi permukaan cairan dalam tabung Kelemahan metode ini adalah:

a. Tak semua hemoglobin menjadi hematin asam, misalnya karboksihemoglobin (Hb-CO), methemoglobin dan sulfhemoglobin

b. Kemampuan visual pemeriksa sangat mempengaruhi hasil

c. Cahaya yang kurang terang mempengaruhi hasil

Penghitungan sel-sel darah

Lekosit, eritrosit dan trombosit dihitung setelah diencerkan. Pada laboratorium besar, penghitungan dilakukan secara elektronik dan pengenceran otomatis sehingga memberikan hasil yang sangat akurat. Selanjutnya cara ini tak dibahas. Selain itu, masih ada cara manual yang tetap diperlukan hingga saat ini yaitu menggunakan pipet dan kamar hitung.

Penghitungan lekosit

untuk menghitung lekosit, darah diencerkan dalam pipa lekosit lalu dimasukkan ke dalam kamar hitung. Pengencer yang digunakan adalah larutan Turk. Langkah-langkah pemeriksaan yang diterapkan adalah:

1. Hisap darah kapiler, darah EDTA atau darah oksalat sampai tanda 0,5

2. Hapus kelebihan darah di ujung pipet

3. Masukkan ujung pipet ke dalam larutan Turk dengan sudut 45 derajat, tahan agar tetap di tanda 0,5. Isap larutan Turk hingga mencapai tanda 11. Jangan sampai ada gelembung udara

4. Tutup ujung pipet dengan ujung jari lalu lepaskan karet penghisap

5. Kocok selama 15-30 detik

6. Letakkan kamar hitung dengan penutup terpasang secara horisontal di atas meja

7. Kocok pipet selama 3 menit, jaga agar cairan tak terbuang dari pipet

8. Buang semua cairan di batang kapiler (3-4 tetes) dan cepat sentuhkan ujung pipet ke kamar hitung dengan menyinggung pinggir kaca penutup dengan sudut 30. Biarkan kamar hitung terisi cairan dengan daya kapilaritas

9. Biarkan 2-3 menit supaya lekosit mengendap

10. Gunakan lensa obyektif mikroskop dengan pembesaran 10 kali, fokus dirahkan ke garis-garis bagi.

11. Hitunglah lekosit di empat bidang besar dari kiri atas ke kanan, ke bawah lalu ke kiri, ke bawah lalu ke kiri dan seterusnya. Untuk sel-sel pada garis, yang dihitung adalah pada garis kiri dan atas.

12. Jumlah lekosit per µL darah adalah: jumlah sel X 50

Penghitungan eritrosit

Untuk menghitung eritrosit, darah diencerkan dalam pipa eritrosit lalu dimasukkan kedalam kamar hitung. Pengencer yang digunakan adalah larutan Hayem. Langkah-langkah pemeriksaan yang diterapkan adalah:

1. Hisap darah kapiler, darah EDTA atau darah oksalat sampai tanda 0,5

2. Hapus kelebihan darah di ujung pipet

3. Masukkan ujung pipet ke dalam larutan Hayem dengan sudut 45, tahan agar tetap ditanda 0,5. Isap larutan Hayem hingga mencapai tanda 101. Jangan sampai ada gelembung udara

4. Tutup ujung pipet dengan ujung jari lalu lepaskan karet penghisap

5. Kocok selama 15-30 detik

6. Letakkan kamar hitung dengan penutup terpasang secara horisontal di atas meja

7. Kocok pipet selama 3 menit, jaga agar cairan tak terbuang dari pipet

8. Buang semua cairan di batang kapiler (3-4 tetes) dan cepat sentuhkan ujung pipet ke kamar hitung dengan menyinggung pinggir kaca penutup dengan sudut 30. Biarkan kamar hitung terisi cairan dengan daya kapilaritas

9. Biarkan 2-3 menit supaya eritrosit mengendap

10. Gunakan lensa obyektif mikroskop dengan pembesaran 40 kali, fokus dirahkan ke garis-garis bagi dalam bidang besar yang tengah.

11. Hitunglah eritrosit di 5 bidang sedang yang masing-masing tersusun atas 16 bidang kecil, dari kiri atas ke kanan, ke bawah lalu ke kiri, ke bawah lalu ke kiri dan seterusnya. Untuk sel-sel pada garis, yang dihitung adalah pada garis kiri dan atas.

12. Jumlah lekosit per µL darah adalah: jumlah sel X 10000

 Penghitungan trombosit

Ada 2 cara penghitungan trombosit yaitu cara langsung dan cara tak langsung. Cara tak langsung tidak dibahas dalam kuliah ini. Untuk menghitung trombosit secara langsung, darah diencerkan dalam pipet eritrosit lalu dimasukkan ke dalam kamar hitung. Pengencer yang digunakan adalah larutan Rees Ecker. Langkah-langkah pemeriksaan yang diterapkan adalah:

1. Hisap cairan Rees Ecker sampai tanda “1” dan buang lagi cairan tersebut

2. Hisap darah sampai tanda 0,5 dan cairan Rees Ecker sampai tanda 101 lalu kocok selama 3 menit

3. Lanjutkan langkah-langkah seperti penghitungan eritrosit

4. Biarkan kamar hitung selama 10 menit dalam posisi horisontal supaya trombosit mengandap

5. Hitunglah trombosit dalam seluruh bidang besar tengah dengan lensa obyektif besar

6. Jumlah trombosit per µL darah adalah: jumlah trombosit x 2000.

Sediaan hapusan darah

Sediaan hapusan darah penting untuk pemeriksaan keadaan trombosit, keadaan eritrosit dan keadaan lekosit. Cara membuat sediaan hapusan darah dapat menggunakan kaca obyek dan menggunakan kaca penutup. Dalam kuliah ini hanya kita bahas cara yang pertama saja yaitu:

1. Sentuhlah setetes kecil darah (diameter maksimal 2 mm) kira-kira 2 cm dari tepi kaca obyek. Darah yang dipakai adalah darah kapiler, darah heparin atau darah EDTA.

2. Letakkan kaca obyek dengan darah di sebelah kanan

3. Dengan tangan kanan, letakkan kaca obyek lain di kiri tetes darah, lalu gerakkan ke kanan sampai menyentuh darah

4. Tunggu darah menyebar sampai ½ cm dari sudut kaca penggese

5. Geser kaca ke kiri dengan sudut 30-45, jangan menekan ke bawah

6. Biarkan sediaan mengering di udara

7. Tulis nama klien dan tanggal pada bagian sediaan yang tebal Setelah hapusan darah selesai, dilanjutkan dengan pewarnaan dengan berbagai cara misalnya pewarnaan Wright dan Giemsa.

Ada beberapa kelainan morfologi eritrosit antara lain:

1. Anisositosis (abnormalitas ukuran eritrosit).

Contoh mikrosit (eritrosit lebih kecil dari normal) pada kasus anemia defisiensi besi dan makrosit (eritrosit lebih besar dari normal) pada kasus anemia defisiensi asam folat.

2. Poikilositosis (abnornalitas bentuk eritrosit yaitu ada yang tidak bundar)

Contohnya adalah kondisi hemoglobin patologik dan beberapa jenis anemia. 

3. Polikromasi (terdapat beberapa eritrosit dengan warna kebiruan di antara eritrosit normal yang berwarna merah)

Polikromasi menunjukkan adanya eritrosit yang masih muda.

4. Hipokrom (bagian pucat di tengah eritrosit meluas). Keadaan ini menunjukkan rendahnya kadar hemoglobin

5. Sferosit (eritrosit mendekati bentuk bola) Contoh kasus ini adalah anemia hemolitik

Keadaan lekosit

Dalam pemeriksaan keadaan lekosit yang perlu diperhatikan adalah hitung jenis (differential counting) lekosit. 

Hitung jenis adalah menghitung 100 lekosit dan mengelompokkan  berdasarkan jenisjenisnya.

Urutan pengelompokan adalah basofil, eosinofil, netrofil (batang dan segmen), limfosit dan monosit. Nilai normal dari hitung jenis adalah basofil: 0-1%, eosinofil: 1-3%, netrofil batang: 2-6%, netrofil segmen: 50-70%, limfosit: 20-40% dan monosit: 2-8%.

Menghitung retikulosit

Setelah eritrosit muda kehilangan inti, sebagian kecil RNA tertinggal di dalam eritrosit. Sel ini dinamakan retikulosit. Jumlah retikulosit normal adalah 0,5-1,5% dari jumlah eritrosit, yaitu 25000-75000 per µL darah.

Laju endap darah (LED)

Laju endap darah adalah kecepatan pengendapan eritrosit, oleh karena itu untuk mengukurnya diperlukan darah dengan anti koagulan. Ada 2 cara pemeriksaan LED yaitu cara Wintrobe dan cara Westergren. Pada kuliah ini hanya diberikan contoh cara Wintrobe, dengan langkah langkah sebagai berikut:

1. Ambil darah EDTA atau darah oksalat

2. Dengan menggunakan pipa Wintrobe, masukkan darah ke dalam tabung Wintrobe hingga tanda 0 mm. Cegah terjadinya gelembung udara.

3. Biarkan tabung Wintrobe dalam posis tegak lurus selama 60 menit

4. Bacalah tinggi lapisan plasma dalam milimeter dan catat sebagai LED. Nilai LED normal adalah pria: < 10 mm/jam dan wanita: < 15 mm/jam

Hematokrit

Hematokrit adalah volume semua eritrosit dalam 100 ml darah. Ada 2 cara pemeriksaan hematokrit yaitu cara Wintrobe dan cara mikrometode. Pada kuliah ini hanya dibahas cara Wintrobe, dengan langkah langkah pemeriksaan sebagai berikut:

1. Ambil kapiler atau darah EDTA, darah heparin atau darah oksalat lalu masukkan ke dalam tabung Wintrobe hingga tanda 100 di atas.

2. Masukkan tabung ke dalam sentrifuge yang cukup besar lalu pusingkan selama 30 menit dengan kecepatan 3000 rpm

3. Bacalah hasilnya dengan memperhatikan:

a. Plasma di atas (kuning) dibandingkan dengan kaliumbikromat dan intensitasnya disebut satuan. Satu satuan adalah 1:10000

b. Ketebalan lapisan putih (lekosit dan trombosit)

c. Volume sel-sel darah merah.

Nilai hematokrit normal adalah pria: 40-48% dan wanita: 37-43%

Masa perdarahan (bleeding time)

Masa perdarahan digunakan untuk menilai faktor-faktor ekstravaskuler dari hemostasis (pembekuan darah). Ada 2 cara pemeriksaan yang lazim digunakan yaitu cara Ivy dan cara Duke. Langkah-langkah pemeriksaan masa perdarahan adalah:

1. Bersihkan bagian voler lengan bawah (cara Ivy) atau anak daun telinga (cara Duke) dengan alkohol 70% dan tunggu sampai kering. 

2. Khusus untuk cara Ivy pasang manset sfigmomanometer pompa sampai batas tekanan 40 mmHg lalu pertahankan tekanan tersebut 

3. Cara Ivy: tegangkan kulit dan tusuk dengan lanset sedalam 3 mm di lokasi 3 jari dibawah lipat siku

Cara Duke: tusuk pinggir anak daun telinga dengan lanset sedalam 2 mm

4. Ketika darah mulai keluar, hidupkan stopwatch

5. Isap tetesan darah dengan kertas saring tiap 30 detik, cegah menekan kulit saat menghisap darah

6. Ketika darah tak terhisap hentikan stopwatch dan catatlah waktunya

Masa perdarahan normal adalah 1-6 menit. Jika melampaui 10 menit perdarahan belum berhenti, hentikan percobaan. Batalkan percobaan jika hasil percobaan kurang dari 1menit, karena terjadi akibat kurang dalamnya tusukan.

Masa pembekuan (clotting time)  

Masa pembekuan digunakan untuk menilai faktor-faktor pembekuan darah, khususnya faktor pembentuk tromboplastin dan faktor trombosit, serta kadar fibrinogen. Ada 2 cara pemeriksaan yang lazim digunakan yaitu modifikasi cara Lee dan White serta cara Duke. Langkah-langkah untuk pemeriksaan dengan modifikasi cara Lee dan White adalah:

1. Sediakan dalam rak 4 tabung berdiameter 7-8 mm

2. Ambil 5 cc darah vena, saat darah masuk semprit jalankan stopwatch.

3. Masukkan 1 cc darah ke dalam setiap tabung

4. Tiap 30 detik, angkat tabung pertama dan miringkan untuk melihat bekuan. Cegah tabung lain agar tak bergoyang

5. Setelah darah di tabung pertama membeku, periksa tabung kedua tiap 30 detik. Catatlah waktunya

6. Lakukan langkah berikutnya untuk tabung ketiga dan keempat

7. Masa pembekuan adalah masa pembekuan rata-rata dari tabung kedua, ketiga dan Keempat

Masa pembekuan normal adalah 9-15 menit. Masa pembekuan melebihi 20 menit menunjukkan abnormalitas

Pemeriksaan golongan darah

Ada berbagai macam penggolongan darah, namun yang akan kita praktikkan pada kesempatan ini adalah penetapan sistem golongan darah ABO. Tanpa melihat subgroup ada 4 macam golongan darah, yaitu:

1. A: eritrosit mengandung aglutinogen A dan serum aglutinin anti B

2. B: eritrosit mengandung aglutinogen B dan serum aglutinin anti A

3. O: eritrosit tak mengandung aglutinogen dan serum mengandung aglutinin anti A dan anti B

4. AB: eritrosit mengandung aglutinogen A dan B, sedangkan serum tidak mengandung aglutinin

Penetapan golongan darah menentukan jenis aglutinogen dalam sel. Selain itu dikenal pula penetapan agglutinin dalam serum. Cara terbaik adalah dengan menggunakan kedua penetapan yaitu aglutinogen dan agglutinin.

1. Taruh di bagian kiri object glass 1 tetes serum anti A dan di bagian kanan 1 tetes serum anti B

2. Tambahkan 1 tetes kecil darah pada serum, kemudian campurlah dengan ujung lidi

3. Goyangkan object glass dengan gerakan melingkar

4. Perhatikan aglutinasi dengan mata telanjang, lalu benarkan dengan menggunakan mikroskop.

Catatan:

 Warna serum anti A: hijau/biru

 Warna serum anti B: kuning

 Darah yang diperiksa boleh darah kapiler segar atau darah vena yang telah membeku terlebih dahulu yang kemudian sel-selnya dilepaskan memakai ujung lidi. Jumlah darah yang dicampur dengan serum sebaiknya mencapai nilai hematokrit 2%. Anti serum kuat memberikan hasil tegas dalam waktu kurang dari 1 menit, sebaiknya

hasil diperiksa setelah 2 menit dan selanjutnya disusul pemeriksaan ulang setelah lewat 20 menit. Tindakan terakhir mengamankan adanya subgroup lemah dalam golongan A. Jaga jangan sampai bahan pemeriksaan mengering pada object glass.Untuk menghindari kesalahan, sebaiknya gunakan juga serum anti A,B (serum golongan O). Ini berguna untuk mendapatkan subgroup A yang lemah, yang tidak bereaksi dengan serum Anti A. Object glass harus bersih benar, tidak boleh ada sisa zat kimia atau darah. Hal ini menghindari adanya aglutinasi palsu.

Pedoman kesimpulan:

Anti A Anti B Anti A,B Golongan darah

- - - O

+ - + A

- + + B

+ + + AB

Keterangan: + : terjadi aglutinasi,  - : tidak terjadi aglutinasi

Pemeriksaan darah untuk HIV

Untuk kasus HIV, pemeriksaan darah yang diperlukan adalah ELISA. Pemeriksa ELISA dilakukan secara langsung dan secara tak langsung. 

Pemeriksaan ELISA secara langsung

Langkah-langkah pemeriksaan ini adalah:

1. Antibodi diletakkan di lempeng ELISA (ELISA plate)

2. Sampel darah dimasukkan sehingga terbentuk ikatan antigen-antibodi

3. Enzyme-linked antibody spesific untuk menguji antigen ditambahkan dan mengikat antigen, membentuk sandwich

4. Substrat enzim ditambahkan dan reaksi menghasilkan produk yang menyebabkan perubahan warna

Pemeriksaan ELISA secara tak langsung

Langkah-langkah pemeriksaan ini adalah:

1. Antibodi diletakkan di lempeng ELISA (ELISA plate)

2. Antiserum pasien dimasukkan sehingga terbentuk ikatan antigen-antibodi

3. Enzyme-linked anti HISG ditambahkan dan mengikat antibodi

4. Substrat enzim ditambahkan dan reaksi menghasilkan produk yang menyebabkan perubahan warna